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前言Hello小伙伴们大家好，我是生信技能树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第八期。第七期我们使用AddModuleScore_UCell函数计算细胞的增殖和迁移评分。本期，我们将使用monocle2进行拟时序分析。
1.背景介绍系列推文前七期，我们共同学习了单细胞测序的基础分析，从第八期开始，我们将陆续学习拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis），“Copykat”分析及细胞通讯等高级分析。
疾病是一个动态变化的过程，在疾病发生发展的过程中，细胞状态随时间不断变化。现有的单细胞测序技术提供的是某一时刻的“快照”，然而通过拟时序分析，我们可以推断出细胞的动态变化过程。
拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）的定义如下：
拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）是一种分析方法，通常用于研究那些在时间上不连续的数据集。它试图通过模拟时间序列的方式来分析数据，即使数据本身并不是按照时间顺序收集的。这种分析方法在多个领域都有应用，比如在生物信息学中，它可以用于分析基因表达数据，即使这些数据不是在连续的时间点上收集的。拟时序分析的关键在于构建一个虚拟的时间轴，然后在这个时间轴上对数据进行排序和分析。这通常涉及到以下几个步骤：数据预处理：清洗数据，确保数据的质量和一致性。特征选择：识别和选择对分析有用的特征或变量。时间轴构建：根据数据的特性构建一个虚拟的时间轴，这可能基于生物学过程、实验设计或其他逻辑。排序：将数据按照虚拟时间轴进行排序。分析：使用时间序列分析的方法来分析排序后的数据，比如趋势分析、周期性分析等。验证：通过交叉验证或其他方法来验证分析结果的可靠性。*
单细胞拟时序分析的主要目的包括：
细胞发展轨迹推断：通过分析细胞状态的变化，推断细胞是如何从一种状态发展或分化到另一种状态。细胞状态排序：将细胞按照它们在假定的发展轨迹上的位置进行排序，即使这些细胞并非在连续的时间点上被观测。生物学过程理解：识别细胞在特定生物学过程中的动态变化，如细胞分化、发育、疾病进展等。关键基因和调控网络识别：发现在细胞状态转变中起关键作用的基因和调控网络。细胞异质性探究：揭示细胞群体内部的异质性，以及不同细胞亚群之间的关系。细胞命运预测：基于当前的细胞状态和拟时序轨迹，预测细胞可能的未来发展和分化命运。动态生物学过程建模：构建数学模型来模拟细胞状态的动态变化，为生物学假设提供定量描述。疾病研究和治疗靶点发现：在疾病研究中，拟时序分析可以帮助理解病理状态下细胞的变化，发现潜在的治疗靶点。发育过程的细胞谱系构建：在发育生物学中，拟时序分析有助于构建细胞谱系树，理解细胞的起源和命运。实验设计指导：通过理解细胞状态的变化，可以指导未来的实验设计，例如选择哪些细胞状态进行进一步的实验验证。Monocle是目前最常用的拟时序分析算法，其核心技术是一种机器学习算法——反向图形嵌入(Reversed Graph Embedding)进行降维分析。Monocle2使用DDRtree进行降维分析，而Monocle3则使用UMAP降维，可视化细胞转录特征相似性关系，从而描述细胞状态过渡轨迹。细胞状态过渡轨迹是“根”到“叶”的树状结构，细胞从根到达分支后，会选择一个分支往远处移动，最后到达叶子，每个细胞的psudotime值是它从叶返回根的距离。
monocle的分析流程与seurat类似，准备输入文件，创建monocle对象cds(new cell data set),对数据预处理，筛选特定基因，降维，计算psudotime值，最后可视化。本期使用monocle2进行拟时序分析。
2.数据分析2.1 导入数据清除系统环境变量，设置工作目录，加载R包，选择做拟时序的亚群，读取恶性上皮细胞RDS文件：
rm(list=ls())getwd()setwd('')library(tidyverse)library(tinyarray)library(data.table) library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)library(monocle)sce.all = readRDS('malignant.rds')sce = sce.alltable(sce$celltype)Idents(sce) = sce$celltype如果用自己电脑，细胞量太大，可以每个细胞亚群抽样 ：
allCells=names(Idents(sce))allType = levels(Idents(sce))# choose_Cells = unlist(lapply(allType, function(x){# cgCells = allCells[Idents(sce)== x ]# cg=sample(cgCells,10)# cg# }))# cg_sce = sce[, allCells %in% choose_Cells]cg_sce = scetable(Idents(cg_sce))2.2 数据准备monocle构建CDS需要3个矩阵：
expr.matrixphenodata（pd）featuredata（fd）expr.matrix：
Mono_tj<-cg_sceMono_matrix<-as(as.matrix(GetAssayData(Mono_tj,slot = "counts")), 'sparseMatrix')
构建featuredata:
一般需要两个col，一个是gene_id,一个是gene_short_name,row对应counts的rownames：
feature_ann<-data.frame(gene_id=rownames(Mono_matrix),gene_short_name=rownames(Mono_matrix))rownames(feature_ann)<-rownames(Mono_matrix)Mono_fd<-new("AnnotatedDataFrame", data = feature_ann)构建phenodata：
Seurat object中的@meta.data一般会存放表型相关的信息如cluster、sample的来源、group等，所以选择将metadata转换为phenodata：
sample_ann<-Mono_tj@meta.datarownames(sample_ann)<-colnames(Mono_matrix)Mono_pd<-new("AnnotatedDataFrame", data =sample_ann)2.3 monocle分析流程构建new cell data set：
Mono.cds<-newCellDataSet(Mono_matrix,phenoData =Mono_pd,featureData =Mono_fd,expressionFamily=negbinomial.size())
newCellDataSet函数中，expressionFamily参数用于指定表达矩阵的数据类型，有几个选项可以选择：稀疏矩阵用negbinomial.size()；FPKM值用tobit()；logFPKM值用gaussianff()。
查看phenodata、featuredata：
head(pData(Mono.cds))head(fData(Mono.cds))
Mono.cds相当于Seurat V5构建的Seurat对象，随后需要对数据预处理（估计尺度因子、估计离散度）：
Mono.cds <- estimateSizeFactors(Mono.cds)Mono.cds <- estimateDispersions(Mono.cds)
筛选基因,这里可以根据自己的需要筛选特定的基因：
disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)Mono.cds <- setOrderingFilter(Mono.cds, unsup_clustering_genes$gene_id)
用DDRtree进行降维分析：
Mono.cds <- reduceDimension( Mono.cds, max_components = 2, method = 'DDRTree')
计算psudotime值：
Mono.cds <- orderCells(Mono.cds)head(pData(Mono.cds))
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2.4 monocle可视化展示State轨迹分布图：
plot_cell_trajectory(Mono.cds,cell_size = 1)
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展示Cluster/Pseudotime轨迹分布图：
p1 = plot_cell_trajectory(Mono.cds,color_by="celltype", size=1,show_backbone=TRUE)p2 = plot_cell_trajectory(Mono.cds,color_by="Pseudotime", size=1,show_backbone=TRUE) p1+p2
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分面显示：
plot_cell_trajectory(Mono.cds, color_by = "celltype") + facet_wrap("~sample", nrow = 1)图片
树形图：
plot_complex_cell_trajectory(Mono.cds,x=1,y=2,color_by="celltype")+ scale_color_manual(values =mycolors)+ theme(legend.title = element_blank())
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沿时间轴的细胞密度图：
library(ggpubr)df <- pData(Mono.cds)view(df)
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ggplot(df,aes(Pseudotime, colour = celltype, fill=celltype))+ geom_density(bw=0.5,size=1,alpha =0.5)+theme_classic2()
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Monocle基因可视化：
head(unsup_clustering_genes)s.genes <- c("NOC2L","PLEKHN1","HES4","ISG15")p1 <- plot_genes_jitter(Mono.cds[s.genes,], grouping = "State", color_by = "State")p2 <- plot_genes_violin(Mono.cds[s.genes,], grouping = "State", color_by = "State")p3 <- plot_genes_in_pseudotime(Mono.cds[s.genes,], color_by = "State")图片
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拟时相关基因聚类热图：
#高变基因disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)diff_test <- differentialGeneTest(Mono.cds[disp.genes,], cores = 4, fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test, qval < 1e-50))plot_pseudotime_heatmap(Mono.cds[sig_gene_names,], num_clusters=4, show_rownames=T, return_heatmap=T)
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2.5 BEAM分析由于细胞基因表达模式不同,单细胞轨迹中通常包括分支。通过BEAM(Branched expression analysis modeling)分析，我们可找到以依赖于分支的方式调控的基因。
disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)mycds_sub <- Mono.cds[disp.genes,]plot_cell_trajectory(mycds_sub, color_by = "State")beam_res <- BEAM(mycds_sub, branch_point = 1, progenitor_method = "duplicate")beam_res <- beam_res[order(beam_res$qval),]beam_res <- beam_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]mycds_sub_beam <- mycds_sub[row.names(subset(beam_res, qval < 1e-4)),]plot_genes_branched_heatmap(mycds_sub_beam, branch_point = 1, num_clusters = 3, show_rownames = T)图片
结语本期，我们进入了单细胞高级分析系列，使用monocle2进行了拟时序分析。下一期，根据课程安排，我们将暂时回到Bulk转录组，利用TCGA-STAD数据进行生存分析。干货满满，欢迎大家持续追更，谢谢！
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